課題來源：國家自然科學(xué)基金(81170998)、廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2012032)

研究背景：
在當(dāng)今所有的種植體材料中，純鈦因其良好的生物相容性和機械加工性能已經(jīng)廣泛應(yīng)用于口腔種植領(lǐng)域。種植牙因為美觀、舒適、并能很好的恢復(fù)咀嚼功能，作為人類的第三副牙齒，近年來被廣泛接受。但是種植牙仍存在一些問題，如骨結(jié)合率較低，愈合時間較長，種植體植入體內(nèi)到臨床負重一般都需要周的時間，這一定程度上限制了種植修復(fù)的臨床應(yīng)用。研究表明，大部分種植失敗發(fā)生于種植體早期愈合的過程中，愈合速度越慢，種植體受到各種風(fēng)險因素的影響越大，種植失敗的風(fēng)險越高。

影響種植體表面早期成骨有兩個因素：受區(qū)的生物學(xué)特性；種植體的表面特性。

在種植早期，種植體植入機體后，與骨組織間存在兩種不同的愈合模式：接觸成骨和距離成骨。接觸成骨，指成骨細胞與種植體表面接觸后直接分泌骨基質(zhì)，其骨生長方向是由種植體表面向種植窩周圍的骨組織表面生長。而距離成骨與之相反，是新生骨基質(zhì)沉積在種植體附近和種植窩周圍的原有骨組織表面，其生長的方向為種植窩周圍骨組織向種植表面生長。研究發(fā)現(xiàn)：接觸成骨在種植體表面直接形成的編織骨有利于增加種植體初期和早期機械穩(wěn)定性。盡快建立接觸成骨所需的條件，有利于促進骨組織形成。骨組織愈合的速率和程度依賴于種植體表面接觸成骨的程度。

受區(qū)的生物學(xué)特性是指受區(qū)骨的解剖生理學(xué)，包括骨代謝特點、骨密度、血供、生長因子、成骨細胞來源等。不同的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了不同的骨生物力學(xué)和不同的骨愈合骨改建能力。研究證明:不同的動物在相同部位植入相同的材料，實驗結(jié)果有差異，在同一動物，將生物材料植入不同的部位，結(jié)果也有差異。Guehennec LL將骨代用品分別植入兔的股骨、顱骨和脛骨，觀察4周，發(fā)現(xiàn)骨愈合在兔股骨是48.5%，顱骨是22.9%，脛骨是12.6%。這可能是由于不同部位的骨結(jié)構(gòu)不同，包括皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨分布特點不同。不同的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了不同的骨愈合骨改建能力。同一植入部位不同區(qū)域的骨愈合能力也有所差異。

本課題組曾在兔脛骨距離干骺端三個不同距離處分別植入三枚種植體，結(jié)果顯示，距離于骺端最近的骨-種植體接觸率最高，接觸成骨最明顯，骨愈合最快。然而，在頜骨的不同部位，種植體表面的成骨是否有差異呢？在頜骨的哪一區(qū)域，接觸成骨效果最好呢?目前尚無較肯定的研究結(jié)果。

種植體的表面特性是指種植體的表面形貌、元素組成、分子結(jié)構(gòu)、電荷狀態(tài)、表面自由能、親疏水性特性等。種植體表面經(jīng)過處理，可改變其表面特性，促進接觸成骨，縮短骨整合所需的時間。為了有效地縮短種植體骨結(jié)合所需的時間，在過去的二十年中，一系列鈦表面處理技術(shù)不斷涌現(xiàn)：如鈦漿涂層、羥基磷灰石涂層、噴砂酸蝕、激光處理，微弧氧化等。其中，噴砂酸蝕是被研究得最多的一種表面處理方法，無論從其表面形貌、表面粗糙度還是生物相容性和骨引導(dǎo)性等方面，都有許多的研究報道，它已成為國際上使用最為廣泛的種植體表面之一，其表面良好的機械生物相容性已經(jīng)得到了公認(rèn)。大量的研究已經(jīng)證實：噴砂酸蝕的種植體表面具有良好的早期骨結(jié)合效果，是一種比較成熟的表面處理方法。

然而，傳統(tǒng)的噴砂加酸蝕表面處理制備完成后被置于空氣中干燥會由相對親水性變成疏水性。研究顯示，疏水性表面將減少蛋白吸附，同時潤濕性不足也會影響材料表面接觸血液成分的初始狀態(tài)以及后續(xù)的細胞反應(yīng)。種植體表面潤濕性在很大程度上取決于表面自由能。表面自由能增加能使材料表面潤濕性增加。種植體潤濕性和表面自由能的增加可以增強種植體表面與生物環(huán)境的相互作用，從而影響到種植體生物活性的發(fā)揮，甚至骨結(jié)合的長期效果。

不同的表面處理方法會影響表面自由能的大小。自年由等領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，首次使用紫外線對二氧化鈦膜進行表面處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)紫外線處理過的二氧化鈦膜層由疏水性能向超親水性能轉(zhuǎn)變，并將其成果發(fā)表在上之后，研究人員開始關(guān)注紫外線改性鈦表面。到目前為止，較多的研究證明：紫外光催化反應(yīng)是改性鈦表面，提高表面自由能并獲得超親水特性的一種簡單、
方便和高效的方法。

本課題組前期對紫外線輻照噴砂酸蝕純鈦表面進行了理化分析和細胞學(xué)實驗，結(jié)果顯示：表面處理降低了碳氫化合物的含量低，同時，與表面相比，表面具有親水性和高表面能促進了成骨細胞的粘附、增殖、分化和礦化；體外礦化誘導(dǎo)能力檢測顯示，表面誘導(dǎo)羥基磷灰石
礦化沉積的速度是表面的倍。這些結(jié)果與國外有關(guān)紫外線研究是一致的。

大量的研究表明：那些由于長時間存放而老化的種植體在受到紫外線輻照后，其表面活性得以復(fù)活，提高表面自由能并同時獲得親水特性，促進了蛋白吸附、成骨細胞粘附、增殖、分化和礦化，甚至骨結(jié)合，顯示出良好的生物相容性。

然而，就目前而言，國內(nèi)外有關(guān)紫外線轄照的研究大部分集中在理化性質(zhì)和細胞學(xué)實驗，體內(nèi)實驗方面的研究相對較缺乏。那么，在體內(nèi)實驗中，通過紫外線輻照純鈦表面，改變噴砂酸蝕純鈦表面這一經(jīng)典表面的自由能，鈦種植體表面的成骨現(xiàn)象又是怎樣的呢？

實驗?zāi)康模?/strong>
鑒于以上問題和爭議，本研究的第一個目的是研究受區(qū)生物學(xué)特性與噴砂酸蝕鈦種植體表面接觸成骨的關(guān)系；第二個目的是研究紫外光處理對噴砂酸蝕鈦種植體接觸成骨的影響。

研究方法：
1、實驗動物：成年雄性健康的Beagle犬共4只，12月齡，體重為14-15kg。牙齒牙列完整，無慢性牙周病及齲齒，口腔粘膜色澤正常，咬合關(guān)系無明顯異常。
2.、Beagle犬拔牙:4只Beagle犬適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，術(shù)前12小時禁飲食，術(shù)前半小時肌注青霉素鈉40萬u，速眠新和戊巴比妥鈉復(fù)合麻醉下微創(chuàng)拔除雙側(cè)第二、三、四前磨牙和第一磨牙，術(shù)后連續(xù)三天給予青霉素80萬單位肌注，以預(yù)防感染。術(shù)后進軟食一周。拔牙創(chuàng)愈合三個月。
3、種植體選擇:種植體為WEGO種植體，長度為9mm，直徑為38mm，表面處理是SLA，作為對照組。
4、種植體UV輻照：選用Philips的UVC滅菌燈，使用UVC滅菌燈前先用75%酒精棉球擦拭燈管，再在無菌環(huán)境下距離材料表面10cm，對SLA種植體表面照射48h。SLA+UV處理，作為實驗組。
5、分組：使用隨機數(shù)字表按隨機分配的原則，將4只成年雄性健康Beagle犬分為2周組和4周組，每組各有2只。
采用左右半口對照設(shè)計，每只Beagle犬每邊下頜骨植入5顆種植體，一邊為實驗組(SLA+UV)，一邊為對照組(SLA)，每只Beagle犬植入10顆種植體，4只Beagle犬共植入40顆種植體。其中SLA組和SLA+UV組各有20個樣本。
SLA組的20個樣本先用于分析受區(qū)生物學(xué)特性與接觸成骨的關(guān)系。而后SLA組的20個樣本和SLA+UV組的20個樣本用于分析對比SLA表面處理和SLA+UV表面處理鈦種植體表面接觸成骨現(xiàn)象。
6、種植手術(shù)：拔牙創(chuàng)愈合三個月后。術(shù)前12小時禁飲食，術(shù)前半小時肌注青霉素鈉40萬u。速免新和戊巴比妥鈉肌肉注射麻醉后，常規(guī)消毒鋪巾，下頜骨槽脊頂切開，翻瓣，球鉆定位，逐級預(yù)備種植窩，成型鉆成形種植窩，植入種植體，種植窩大小與種植體是一致的，使種植體外螺紋貼著種植窩骨壁。對位縫合創(chuàng)口。術(shù)后常規(guī)抗炎處理。
7、熒光雙標(biāo)記法：所有成年雄性健康Beagle犬于處死前的第13、14天在皮下注射鹽酸四環(huán)素25mg/kg；處死前的第3、4天皮下注射鈣黃綠素5mg/kg，每種試劑使用時連續(xù)注射兩天，每日注射一次。
8、標(biāo)本處理：分別在2周和4周各處死兩只Beagle犬，獲得帶種植體的Beagle犬下頜骨，以0.9%生理鹽水反復(fù)沖洗，將標(biāo)本切分成單獨種植體，用10%中性福爾馬林固定液浸泡，置于4℃恒溫冰箱保存48-72小時，然后換成70%乙醇浸泡。
9.、顯微CT檢查：取4個含種植體標(biāo)本，進行顯微CT數(shù)據(jù)掃描，并取種植體粗螺紋區(qū)周圍45μm-300微米及300-600微米的空間進行三維重建。
10、不脫鈣的種植體骨切片的制備：EXAKT510系統(tǒng)自動脫水，包埋后，用EXAKT 300CP切片機切片，然后用EXAKT400CS系統(tǒng)自動磨片至30μm，熒光觀察，再用亞甲基藍酸性品紅染色。
11、對比顯微CT的結(jié)果和硬組織切片，選擇更能反映種植體表面成骨的實驗方法。
12、取噴砂酸蝕組切片，觀察種植體在頜骨不同部位的成骨差異，第一部分是種植體螺紋底部到皮質(zhì)骨大約300μm距離的部分，第二部分是種植體螺紋底部到皮質(zhì)骨大約300μm-600μm距離的部分，第三部分是種植體螺紋底部到皮質(zhì)骨大于600μm距離的部分。
13、對噴砂酸蝕組及噴砂酸蝕加紫外光輻照組按實驗?zāi)康男袩晒怆p標(biāo)記及染色觀察分析，評估種植體周圍的骨愈合情況和計算BIC。
14、統(tǒng)計學(xué)處理:
測定數(shù)據(jù)結(jié)果均采用x±s表示，使用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件，正態(tài)分布數(shù)據(jù)先用析因設(shè)計的方差分析分析處理組與時間段之間是否有交互效應(yīng)，如有再用單因素方差分析(one-way ANOVA)，預(yù)先用Levene’s test檢驗方差是否齊性，如方差齊則采用樣品均數(shù)見的兩兩比較的LSD，方差不齊則采取校正的方法Welch 方法，多重比較用 Dunnett’s T3 法。當(dāng)P<0.05時，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

實驗結(jié)果：
1.實驗動物情況：4只Beagle犬術(shù)后6-9小時清醒進食，無死亡動物。種植手術(shù)傷口未見異常，均可達到一期愈合，無明顯出血。無種植體松動。
2.樣本大體觀察：種植體頂部被周圍骨組織和纖維組織等包埋，未見明顯骨吸收的現(xiàn)象，種植體無松動。
3.微型CT觀察：可通過調(diào)整切面，觀察到種植體周圍每個面的成骨情況。可進行目標(biāo)整體分割測量，在任意方向得到切片，得到較完整數(shù)據(jù)。對種植體粗螺紋周圍45μm-300μm范圍，300μm-600μm范圍進行三維重建，兩周時和四周時均可見較多新生骨小梁長入螺紋內(nèi)部，但由于金屬偽影的影響顯示不清，無法進行三維重建。硬組織切片只能取一個方向的截面，但是對種植體表面0-45μm區(qū)域顯示清晰，可以很好地觀察到種植體表面成骨的方向，可以清晰地觀察到接觸成骨現(xiàn)象。

4.噴砂酸蝕種植體與皮質(zhì)骨的不同距離對接觸成骨的影響：
亞甲基藍酸性品紅染色：可見種植體螺紋與皮質(zhì)骨距離不同，螺紋內(nèi)新骨的量不同。2周：種植體螺紋凹槽底部與皮質(zhì)骨大概300μm時，即皮質(zhì)骨是貼著種植體外螺紋的，此時有部分新骨長入螺紋內(nèi)部，種植體表面包括螺紋凹槽底部可見新生骨小梁，有接觸成骨；種植體螺紋凹槽底部與皮質(zhì)骨大概600μm時，可見少量新生骨小梁順著螺紋壁攀爬，種植體螺紋斜壁有少量新生骨小梁，螺紋凹槽底部未見明顯新生骨小梁；種植體螺紋凹槽底部與皮質(zhì)骨距離大于600μm時，未見明顯新骨生成。4周：種植體螺紋凹槽底部與皮質(zhì)骨大概300μm時，此時很多新骨長入螺紋內(nèi)部，分布于螺紋腔及螺紋底壁，斜壁，可見接觸成骨；種植體螺紋凹槽底部與皮質(zhì)骨大概300-600μm時，可見少量新生骨小梁順著螺紋壁攀爬，螺紋底壁新生骨小梁不明顯。種植體螺紋凹槽底部與皮質(zhì)骨距離大于600μm時，極少量新骨生成。

骨組織計量學(xué)：兩周及四周時，對種植體螺紋凹槽底部到皮質(zhì)骨的距離300μm，300-600μm，≥600μm這三個組種植體周圍的，新生骨面積進行測量，發(fā)現(xiàn)：新生種植體螺紋凹槽底部到皮質(zhì)骨的距離300μm時BIC及新生骨面積＞種植體螺紋凹槽底部到皮質(zhì)骨的距離300-600μm時BIC及新生骨面積＞種植體螺紋凹槽底部到皮質(zhì)骨的距離大于或等于600μm的及新生骨面積，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，螺紋凹槽底部與皮質(zhì)骨越近，種植體——骨接觸效果越好。

5.紫外光處理噴砂酸蝕純鈦種植體表面早期成骨效應(yīng)組織學(xué)觀察：
(1)熒光分析：2周組：可見種植體周圍及種植體螺紋內(nèi)都有散在熒光，熒光主要集中在種植體螺紋處，皮質(zhì)骨區(qū)域比骨髓腔區(qū)域熒光分布多。SLA熒光主要集中在螺紋斜壁上和種植體周圍，SLA+UV組，除了種植體周圍和螺紋壁上外，螺紋底部也有更多熒光分布。4周組：可見種植體周圍及種植體螺紋內(nèi)都有散在熒光，熒光主要集中在種植體螺紋處，與2周比，可見骨髓腔區(qū)域(即離皮質(zhì)骨遠的地方)也有新骨生成，且新生骨小梁較2周時粗大。SLA+UV組較SLA組更多熒光分布。目SLA+UV組較SLA組熒光條帶粗。?
(2)骨磨片亞甲基藍-酸性品紅染色：2周，SLA組可見螺紋腔底部無明顯新骨生成，新生骨小梁多來源于周圍基骨，沿著種植體螺紋腔斜壁爬行而來，新生骨小梁細長，顏色稍深；SLA+UV組：見新生骨小梁不僅沿著種植體螺紋腔斜壁爬行，在離基骨遠的螺紋腔底壁，也有較多新骨生成。4周，SLA組可見新骨由周圍基骨往螺紋腔內(nèi)延伸，螺紋腔中間有新生骨小梁，也有新生骨小梁沿著螺紋腔斜壁往內(nèi)生長，螺紋腔底壁散在分布著少量新生骨小梁，種植窩骨壁見大量新形成的哈弗氏系統(tǒng)，螺紋內(nèi)部未見明顯的哈弗氏系統(tǒng)。SLA+UV組：見新生骨小梁不僅分布于離周圍成熟骨近的螺紋腔斜壁，在離基骨遠的螺紋腔底壁也見大量新生骨小梁，接觸成骨非常明顯，同時，螺紋腔側(cè)壁和底壁新生骨小梁都較2周時增粗明顯，除了種植窩骨壁見大量新形成的哈弗氏系統(tǒng)，螺紋內(nèi)部也有新生成的哈弗氏系統(tǒng)。
(3)染色片的骨組織計量學(xué)分析：兩周和四周時，SLA+UV組種植體——骨結(jié)合率＞SLA組種植體——骨結(jié)合率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩周和四周時：SLA組與SLA+UV組新生骨面積百分?jǐn)?shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)論
1.、本實驗采用Beagle犬下頜骨延期種植模型，拔牙后3個月植入種植體，Beagle犬下頜骨與人接近，可比性強，較符合種植臨床實際情況。新的備洞和種植體植入模式，能更清晰地觀察到不同表面處理方法對成骨的影響。
2、顯微CT可以測定骨三維結(jié)構(gòu)，具有連續(xù)性和完整性的優(yōu)勢?？梢院暧^地觀察到種植體周圍骨質(zhì)情況，但是由于金屬偽影的存在，顯微CT對種植體表面接觸成骨現(xiàn)象顯示不夠清晰。硬組織是一種單層組織切片，制作過程較復(fù)雜，而且會破壞標(biāo)本的完整性，從而使得一個標(biāo)本不能同時用于結(jié)構(gòu)參數(shù)分析以外的其他檢測。但是它對于種植體表面成骨的細微變化反映較清晰。
3、SLA鈦種植體表面可觀察到接觸成骨，接觸成骨與受區(qū)的生物學(xué)特性相關(guān)，與皮質(zhì)骨距離近的區(qū)域，接觸成骨效果好，種植體BIC高，BA也高;與皮質(zhì)骨距離大于600μm的區(qū)域，接觸成骨不明顯。
4、SLA+UV組接觸成骨效果好，在兩周和四周時，SLA+UV組種植體——骨結(jié)合率均好于SLA組種植體——骨結(jié)合率。