氟是人體必需的微量元素，適量的氟有利于機(jī)體鈣和磷的利用，增加骨骼的硬度，但長(zhǎng)期超生理劑量攝入可導(dǎo)致氟骨癥。鋁是不是人體必需的元素尚無(wú)定論，但它在體內(nèi)蓄積到一定程度后會(huì)產(chǎn)生毒性作用，也會(huì)造成軟骨和骨的損害。由于環(huán)境中氟鋁元素多于正常,貴州省部分地區(qū)還有氟鋁中毒導(dǎo)致骨骼嚴(yán)重畸形的病例，且易發(fā)骨質(zhì)疏松癥[1-2]。長(zhǎng)期飲用磚茶(氟鋁含量高)，也是內(nèi)蒙古及東北地區(qū)的人群可能發(fā)生氟鋁聯(lián)合中毒的高危因素[3]。因此氟鋁聯(lián)合中毒的深入研究仍然具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前關(guān)于氟鋁聯(lián)合中毒的實(shí)驗(yàn)研究，多數(shù)集中探討骨骼損害與氟鋁劑量的關(guān)系，并且大多是基于體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果［4-5］，對(duì)于短期氟鋁暴露以及停止暴露后藥物干預(yù)對(duì)骨重建狀態(tài)及長(zhǎng)骨生長(zhǎng)發(fā)育影響的研究還少見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)方法觀察氟鋁攝入不同時(shí)間以及停止氟鋁暴露后藥物干預(yù)對(duì)大鼠長(zhǎng)骨縱向生長(zhǎng)以及骨重建的影響，為地方性氟鋁聯(lián)合中毒的深入研究和防治提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.1 試劑與儀器

氟化鈉( NaF; CAS: 7681-49-4; 批號(hào): 20130528; 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)) ，氯化鋁( AlCl3; CAS:7446-70-0; 批號(hào): 20121102; 天津市福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn)) ，牡蠣碳酸鈣片( 25mg·片－1，批號(hào): 120304; 廣州白云山光華制藥股份有限公司生產(chǎn)) ，羅蓋全( 0.25 μg·粒－1，批號(hào): 20130011; 上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn)) 。染色劑甲苯胺藍(lán)( CAS: 92-31-9; 批號(hào):

71041284; Sigma Chemical Co．美國(guó)生產(chǎn)) ; 包埋單體甲基丙烯酸甲酯( CAS: 1330-20-7; 批號(hào): 20161017; 北京化工廠生產(chǎn)) 。不脫鈣制片所需慢速鋸( Buehler，美國(guó)) ，硬組織切片機(jī)( Leica ＲM2265，德國(guó)) ; 骨形態(tài)計(jì)量分析所需熒光顯微鏡( DMLB，Leica，德國(guó)) 及顯微照相機(jī)( Olympus DP72，日本) ，骨形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)量系統(tǒng)( OsteoMetrics3． 1， Inc，美國(guó)) 。

1.2 分組及給藥

48只2 月齡清潔級(jí)SD大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成6組: 對(duì)照45d和90d組，氟鋁45d組和氟鋁90d組［氟鋁( 30mg·kg－1·d－1 NaF + 0.1 mg·kg－1·d－1AlCl3) 暴露45d組和90d組］，氟鋁中斷組( 氟鋁45d后停止暴露) ，藥物干預(yù)組［氟鋁45d 后停止暴露并給予鈣加維生素D( 37.5g·kg－1·d－1 鈣+ 0.052 μg·kg－1·d－1維生素D) 聯(lián)合治療］。年齡對(duì)照組用生理鹽水按10 ml·kg-1用量灌胃，所有藥物配置成一定濃度的溶液，每日1次灌胃，分別給藥45d和90d。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，保持條件: 室溫24～28 ℃，濕度50%～60%。實(shí)驗(yàn)期間根據(jù)每周稱重調(diào)整灌胃給藥量。

1.3 骨形態(tài)學(xué)標(biāo)本制備及形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)測(cè)量

左側(cè)脛骨除凈肌肉和軟組織，矢狀面鋸掉脛骨粗隆部分，暴露骨髓腔，橫斷后取約1cm的脛骨近端固定液中存放，之后經(jīng)逐級(jí)脫水、脫脂，甲基丙烯酸甲酯包埋，打磨光滑后再經(jīng)硬組織切片機(jī)切成10μm和5μm的切片。厚片熒光顯微鏡下進(jìn)行骨代謝及小梁微結(jié)構(gòu)的測(cè)量分析。薄片甲苯胺藍(lán)法染色，光鏡下觀察骺板( 生長(zhǎng)板) 軟骨細(xì)胞層，初級(jí)骨小梁以及初級(jí)小梁往下延伸3 mm 區(qū)域內(nèi)的次級(jí)小梁并進(jìn)行相關(guān)計(jì)量學(xué)分析。其測(cè)量范圍及參數(shù)含義參見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)［6］。

主要微結(jié)構(gòu)參數(shù)有骨小梁容積/總?cè)莘e( bone volume /tissue volume，BV/TV) 、骨小梁厚度( trabecular thickness，Tb.Th) 、骨小梁數(shù)量( trabecular number，Tb.N) 、骨小梁分離度( trabecular separation，Tb.Sp) 及生長(zhǎng)板厚度( growth plate width，G. P. Wi) 等，骨小梁容積即骨量。反映骨形成的參數(shù)有骨小梁熒光周長(zhǎng)/骨小梁周長(zhǎng)( mineralization surface /bone surface，MS /BS) 、骨形成率( bone formation rate /tissue volume，BFＲ/TV) 、成骨細(xì)胞周長(zhǎng)( osteoblast surface，Ob.S) 、類骨質(zhì)周長(zhǎng)( osteoid surface，O.S) 及骨吸收參數(shù)破骨細(xì)胞周長(zhǎng)( osteoclast surface，Oc.S) 等。骨建造單位( bone modeling unit，BMU) 和骨重建單位( bone remodeling unit，BＲU) 分別計(jì)數(shù)。骨建造單位的判斷標(biāo)準(zhǔn)是: 附著于小梁表面，膠原纖維走向與舊骨一致，黏合線( 與舊骨的分界) 光滑，小梁表面雙熒光標(biāo)記多見(jiàn)( 無(wú)熒光的小梁不計(jì)算在內(nèi)) ，小梁的大小、形狀往往發(fā)生改變。骨重建的特點(diǎn)是: 發(fā)生在吸收陷窩內(nèi)，新骨形狀像一個(gè)袋子，纖維走向與舊骨不同，黏合線粗糙，不夠光滑，可見(jiàn)雙熒光或單熒光，小梁基本維持原狀。可疑者及骨形成靜止表面( 無(wú)熒光) 均不計(jì)算在內(nèi)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18. 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以x ± s 表示，不同實(shí)驗(yàn)周期( 45d 和90d) 氟鋁暴露的影響采用雙因素方差分析，相同實(shí)驗(yàn)周期( 90d) 各處理因素的影響采用單因素方差分析，再分別采用LSD-t 檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。P ＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 停止氟鋁暴露及藥物干預(yù)對(duì)大鼠體重的影響

短期( 45d) 內(nèi)不管是否攝入氟鋁，大鼠體重都是逐漸增加的。隨后，氟鋁組體重不增甚至下降，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，氟鋁90d的體重比對(duì)照90d組下降了14.90%( P ＜ 0.05) 。藥物干預(yù)組體重則比氟鋁90d組增加18.90% ( P ＜ 0.05) 。氟鋁中斷組體重介于藥物干預(yù)組和對(duì)照90d組之間。

a 氟鋁90d組與對(duì)照90d組比較，P ＜ 0.05; b 藥物干預(yù)組與氟鋁90d組比較，P ＜ 0.05

圖1 停止氟鋁暴露及藥物干預(yù)后大鼠體重的變化

2.2 停止氟鋁暴露及藥物干預(yù)后大鼠脛骨G. P. Wi及細(xì)胞形態(tài)的變化

與相應(yīng)年齡對(duì)照組比較，氟鋁45 d組和90 d 組的G.P.Wi 分別增加了27.8%( P＜0.01) 和34． 53%( P＜0.01) 。氟鋁45 d 組軟骨細(xì)胞層次清楚，排列整齊，形態(tài)無(wú)異常，而氟鋁90 d 組肥大細(xì)胞擁擠，潴留。氟鋁中斷組的G． P． Wi 為( 173． 43 ± 12.21) μm，高于對(duì)照90 d 組的( 136.62 ± 6.54) μm( P ＜ 0.05) 。藥物干預(yù)組的G.P.Wi( 150.35 ± 10.25) μm，低于氟鋁90 d 組的( 183.80 ± 17.59) μm( P ＜ 0.05) ，與對(duì)照90 d 組接近，且軟骨細(xì)胞層次清楚，形態(tài)未發(fā)現(xiàn)異常。

A.對(duì)照45d組; .氟鋁45d組; C.氟鋁中斷組; D.對(duì)照90d 組; E.氟鋁90d 組; F.藥物干預(yù)組

圖2 停止氟鋁暴露及藥物干預(yù)后大鼠脛骨G.P.Wi 及細(xì)胞形態(tài)的變化(甲苯胺藍(lán)染色× 400)

2.3 停止氟鋁暴露及藥物干預(yù)后大鼠脛骨近端骨小梁微結(jié)構(gòu)的改變

2.4 停止氟鋁暴露及藥物干預(yù)后大鼠脛骨近端骨小梁骨重建的改變

與對(duì)照45d組比較，氟鋁45d組的MS /BS、BFＲ/TV、Ob.S 及O.S 明顯增加。氟鋁90d組的上述指標(biāo)比氟鋁45d組明顯下降，BFＲ/TV 和Ob.S 甚至要低于對(duì)照90d 組。氟鋁中斷組的各項(xiàng)指標(biāo)與年齡對(duì)照90d組和氟鋁90d組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥物干預(yù)組的Oc.S 明顯比對(duì)照90d 組，氟鋁90d組和氟鋁中斷組增加。見(jiàn)表2。

氟鋁45d組的骨形成增加主要是以骨建造為主，即新骨形成增加( 箭頭所示) ，見(jiàn)圖3A。氟鋁45d組的BMU/BＲU 高于對(duì)照45d組( 3.11 ± 0.28 vs 1.44 ±0.42，P ＜ 0.05) ; 氟鋁90 d 組的BMU/BＲU 低于氟鋁45d組( 0.67 ± 0.28 vs 3.11 ± 0.28，P ＜ 0.01) ，與對(duì)照90d組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。氟鋁中斷組BMU/BＲU 仍高于氟鋁90d組( 1.50 ± 0.42 vs 0.67 ± 0.28，P ＜0. 05) 。藥物干預(yù)組表現(xiàn)為骨重建比例增加，即舊骨改造增加( 箭頭所示) ，見(jiàn)圖3B。藥物干預(yù)組的BMU/BＲU 明顯低于氟鋁中斷組( 0.25 ± 0.08 vs 1. 50 ±0. 42，P ＜ 0.05) ，甚至低于對(duì)照90 d 組( 0.25 ± 0.08vs 0.72 ± 0.19，P ＜ 0.05) 。

3 討論

長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板( 即骺板) 中的軟骨細(xì)胞持續(xù)的增殖分化過(guò)程決定著長(zhǎng)骨的生長(zhǎng)。體外研究［7］結(jié)果表明，氟對(duì)軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)低劑量促進(jìn)、高劑量相對(duì)抑制其功能的雙向作用。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)( 短的60d，長(zhǎng)至6個(gè)月) ［8-9］發(fā)現(xiàn)，氟或氟鋁造成大鼠骺板增厚，軟骨礦化延遲甚至壞死。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氟鋁在體內(nèi)短期促進(jìn)、長(zhǎng)期抑制軟骨細(xì)胞功能。這是因?yàn)榉弯X都是帶電荷的離子，可引起體內(nèi)細(xì)胞內(nèi)外Ca2 + 濃度的改變，影響鈣的正常代謝，軟骨基質(zhì)不能及時(shí)礦化為初級(jí)小梁骨。同時(shí)，氟鋁對(duì)軟骨細(xì)胞均有直接毒性作用，氟直接損傷細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，鋁競(jìng)爭(zhēng)性抑制蛋白聚糖與基質(zhì)膠原結(jié)合，形成不成熟的軟骨基質(zhì)［10-11］，還在體內(nèi)與Ca2+、Mg2+、Fe2+等陽(yáng)離子競(jìng)爭(zhēng)，干擾細(xì)胞能量代謝。短期氟鋁暴露時(shí)，體內(nèi)內(nèi)環(huán)境存在一定的代償，僅表現(xiàn)出對(duì)軟骨細(xì)胞的刺激作用。然而，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，氟鋁對(duì)軟骨細(xì)胞和基質(zhì)的毒性作用逐漸累積并顯現(xiàn)。氟鋁組的體重變化( 先增后減) 也間接支持了長(zhǎng)期氟鋁暴露對(duì)長(zhǎng)骨生長(zhǎng)的抑制作用。鈣和維生素D對(duì)生長(zhǎng)板細(xì)胞并沒(méi)有顯著影響，但體重的恢復(fù)間接說(shuō)明了藥物干預(yù)對(duì)整體的積極效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，氟鋁聯(lián)合短期暴露刺激骨形成，長(zhǎng)期則抑制骨形成，骨吸收的改變則不明顯。目前已經(jīng)明確成骨細(xì)胞功能活躍是氟骨癥骨病變中一個(gè)發(fā)生較早、并起主導(dǎo)作用的環(huán)節(jié)［12］。成骨細(xì)胞的激活與細(xì)胞內(nèi)Ｒunt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2( Ｒunx2) 、Wnt /β-連環(huán)蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白( BMP) 、磷脂酰肌醇3-激酶( PI3K) /Akt、刺猬蛋白( Hedgehog) 、胰島素受體等一系列的信號(hào)調(diào)控通道均有關(guān)［13-14］，繼而改變相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)，對(duì)成骨細(xì)胞的增殖分化，凋亡，甚至對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌、礦化等產(chǎn)生影響。此外，氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)外鈣矛盾機(jī)制也與氟對(duì)成骨細(xì)胞的激活密切相關(guān)［15］。鋁對(duì)成骨細(xì)胞的功能則是抑制的，主要還是對(duì)細(xì)胞的直接毒性作用［16］。本實(shí)驗(yàn)中，氟鋁短期內(nèi)只激活骨形成，不但印證了成骨細(xì)胞激活是最先啟動(dòng)的環(huán)節(jié)，同時(shí)也說(shuō)明，在高氟低鋁的聯(lián)合攝入中，短期內(nèi)仍是以氟的作用為主，或者氟對(duì)骨形成的刺激作用掩蓋了低鋁直接抑制骨形成的作用。相對(duì)而言，氟鋁對(duì)破骨細(xì)胞的作用存在許多爭(zhēng)議。有實(shí)驗(yàn)［17］證明，氟對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠破骨細(xì)胞也有低劑量促進(jìn)，高劑量抑制的雙向作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)［18］則發(fā)現(xiàn)，氟暴露時(shí)破骨功能活躍，骨吸收、骨轉(zhuǎn)換均增加，但多數(shù)是基于血清和生化檢測(cè)結(jié)果，基本沒(méi)有直觀的形態(tài)學(xué)資料和數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不管氟鋁暴露時(shí)間長(zhǎng)短，Oc.S 并沒(méi)有明顯改變。BMU/BＲU 增加說(shuō)明氟鋁短期暴露時(shí)，促進(jìn)新骨形成。這種骨建造的特點(diǎn)就是在不同的骨小梁表面發(fā)生，不與骨吸收偶聯(lián)，也解釋了骨吸收為什么沒(méi)有隨著骨形成的增加而增加。

藥物干預(yù)組的骨吸收明顯增加，BＲU 也增加，說(shuō)明鈣和維生素D 干預(yù)促進(jìn)舊骨改造。由于氟離子置換羥基磷灰石中的羥基，形成難溶的氟磷灰石在骨中沉積。鋁是三價(jià)的金屬離子，在體內(nèi)與磷酸鹽形成難溶性磷酸鋁鹽，也在骨骼沉積。因此，雖然氟鋁短期暴露時(shí)成骨是增加的，但并非完全是正常沉積的羥基磷灰石成分。另外，氟和鋁可通過(guò)多種途徑導(dǎo)致整體低

鈣-靶細(xì)胞內(nèi)高鈣的鈣矛盾現(xiàn)象［19］。在這種情況下給予鈣和活性維生素D，細(xì)胞內(nèi)外Ca2 + 濃度差將產(chǎn)生變化，誘發(fā)單核巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞內(nèi)的鈣振蕩，使破骨細(xì)胞數(shù)量增多、功能活躍，增加對(duì)陳舊骨基質(zhì)的吸收［20］，因此，藥物干預(yù)組的骨重建增加，是以正常的鈣磷灰石替代了氟磷灰石、磷酸鋁鹽等異常的沉積物，對(duì)骨小梁的質(zhì)量將發(fā)揮積極的影響。

綜上所述，氟鋁暴露短期內(nèi)促進(jìn)長(zhǎng)骨生長(zhǎng)和骨建造為主的骨形成，長(zhǎng)期則抑制骨生長(zhǎng)及骨形成。氟鋁停止暴露后短期促進(jìn)作用逐漸消失。停止氟鋁暴露后給予鈣和維生素D 聯(lián)合干預(yù)治療不增加骨形成，但增加骨吸收，促進(jìn)舊骨改造，改善骨質(zhì)量。

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