用于骨修復(fù)的生物材料及器械在進(jìn)行臨床試驗(yàn)前均需要進(jìn)行臨床前安全性和有效性動物試驗(yàn)研究，以預(yù)測其應(yīng)用于臨床可能發(fā)生的不良作用[1，2]。骨修復(fù)材料的動物試驗(yàn)研究需要制備合適的骨缺損動物模型，將骨修復(fù)材料植入到制備的骨缺損區(qū)域，評價(jià)骨缺損部位的局部炎癥反應(yīng)、骨整合程度、骨重建情況，對該骨修復(fù)材料的安全性及有效性進(jìn)行評價(jià)[3，4]。生物材料及醫(yī)療器械動物試驗(yàn)周期結(jié)束后，需要剖檢、取樣，切取連帶植入物及其周邊骨組織進(jìn)行病理組織切片制備，以觀察生物材料及醫(yī)療器械與宿主骨組織結(jié)合界面的結(jié)合情況及其在動物體內(nèi)的吸收降解情況。與普通的石蠟包埋組織切片制備方法相比，埋置有植入物的骨組織標(biāo)本進(jìn)行組織切片制備時(shí)采用樹脂包埋病理組織切片制備方法不需要進(jìn)行脫鈣處理，不需要額外剔除組織內(nèi)埋置的植入物，可完整的觀察到植入物與宿主骨組織結(jié)合界面的組織反應(yīng)情況，實(shí)現(xiàn)對植入物與骨組織結(jié)合界面組織細(xì)胞學(xué)變化的研究。本研究對植入了骨修復(fù)材料小型豬腰椎椎體不脫鈣病理組織切片制備方法進(jìn)行了研究，以期能為相關(guān)研究人員提供參考。

1.1.1 組織標(biāo)本

按照《醫(yī)療器械動物試驗(yàn)研究注冊審查指導(dǎo)原則第二部分：試驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施質(zhì)量保證（2021 年第75 號）》進(jìn)行骨修復(fù)材料產(chǎn)品安全性和有效性評價(jià)動物試驗(yàn)研究方案的設(shè)計(jì)與實(shí)施[5]。試驗(yàn)研究制備小型豬腰椎椎體骨缺損動物模型，將委托方提供的骨修復(fù)材料植入到制備的缺損部位，動物試驗(yàn)研究周期結(jié)束后獲得了植入了骨修復(fù)材料的腰椎椎體骨組織標(biāo)本。

1.1.2 主要試劑及儀器設(shè)備

主要試劑：
10 %中性福爾馬林溶液（購自濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司），無水乙醇（購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），蘇木精染液、伊紅染液及甲苯胺藍(lán)染色試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司），Technovit 7200 光聚樹脂（購自德國EXAKT 公司）。

主要儀器設(shè)備：
E300CP 型硬組織切片機(jī)、E400CS 型硬組織磨片機(jī)、E402 型平行粘片裝置、E510 型脫水浸潤儀、E520 型光固化包埋機(jī)、E530 型干燥滲透聚合裝置、E312 型骨組織病理切割機(jī)（德國EXAKT公司）。

骨組織標(biāo)本采用石蠟包埋法進(jìn)行病理切片制作時(shí)，必須先用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、硝酸、甲酸等脫鈣液對骨組織標(biāo)本進(jìn)行脫鈣處理[6-8]。在骨組織內(nèi)埋置有植入物的情況下石蠟包埋組織切片并不適用，原因是硬化后的石蠟雖具有一定的硬度，但其硬度不足以支撐去切組織內(nèi)包埋的植入物，切片過程會造成蠟塊碎裂[9-11]。

樹脂包埋法制備病理組織切片與常規(guī)" 石蠟包埋組織切片" 相比，制片步驟更為復(fù)雜繁瑣，制片周期更長，組織標(biāo)本需要?dú)v經(jīng)組織切割暴露切面、梯度乙醇脫水、不同體積比的Technovit 7200VLC 樹脂/乙醇混合液浸潤、光聚合包埋、制備平行粘片，切片、磨片，才可制備出一張不脫鈣的骨組織病理切片。

上述報(bào)道的骨組織病理切片制備方法所適用的病理染色方法少，這是其缺陷所在，造就了適用范圍受限。同時(shí)，這種方法制備病理切片周期長，僅組織標(biāo)本的浸潤處理過程就需要近40天。其優(yōu)點(diǎn)是骨組織制片過程中不需要脫鈣處理，組織在埋置有植入物的情況下，不需要剔除植入物，這是" 石蠟包埋組織切片" 所實(shí)現(xiàn)不了的，上述報(bào)道的骨組織病理切片制備方法可作為傳統(tǒng)的、經(jīng)典的" 石蠟包埋組織切片技術(shù)方法" 的補(bǔ)充。

利用該技術(shù)方法制備含骨修復(fù)材料腰椎椎體不脫鈣病理組織切片時(shí)，需注意以下細(xì)節(jié)：

（1）若切取的骨組織標(biāo)本體積較大，應(yīng)延長固定時(shí)間且固定過程中，應(yīng)多次更換新的固定液，骨組織標(biāo)本經(jīng)骨組織病理切割機(jī)分切后，應(yīng)該繼續(xù)固定至少12 h，以使組織標(biāo)本得到充分的固定。

（2）因不脫鈣的骨組織標(biāo)本致密緊實(shí)，應(yīng)在抽真空負(fù)壓的條件下進(jìn)行骨組織標(biāo)本的脫水、浸潤處理，以使組織標(biāo)本脫水充分，樹脂包埋液浸潤更加完全，更利于后續(xù)的組織切片制備。

（3）進(jìn)行光聚合固化包埋時(shí)，應(yīng)先利用干燥滲透聚合裝置抽真空，排凈包埋模具內(nèi)殘存的氣泡，以免影響組織塊的聚合、固化。

（4）平行粘片制作過程中應(yīng)利用磨片機(jī)充分對需要觀察的組織切面拋光處理，以免出現(xiàn)組織切片厚薄不一現(xiàn)象。

（5）在磨片時(shí)，磨盤轉(zhuǎn)速應(yīng)設(shè)置的盡可能的低，以免造成植入的骨修復(fù)材料與宿主骨組織脫離，致使長入骨修復(fù)材料的新生骨組織丟失，影響后期的組織病理學(xué)分析。

與普通的石蠟包埋法病理組織切片制備方法不同，本研究采用Technovit 7200 VLC光聚樹脂進(jìn)行骨組織標(biāo)本光固化包埋，借助EXAKT 硬組織病理切磨系統(tǒng)制備骨組織標(biāo)本的不脫鈣病理組織切片，組織切片制備過程中所用的并不是傳統(tǒng)的病理切片刀，而是鑲嵌有金剛石的無齒切割帶鋸，以" 鋸" 的形式對組織進(jìn)行切割，制備組織切片。該方法制備的病理切片最顯著的特點(diǎn)是不需要對骨組織進(jìn)行脫鈣處理，可使骨組織結(jié)構(gòu)形態(tài)保持完好，骨的礦化結(jié)構(gòu)不被破壞，可用于含金屬、陶瓷、骨水泥等骨修復(fù)材料的臨床前安全性和有效性的骨缺損修復(fù)動物試驗(yàn)研究[12]。同時(shí)，該技術(shù)方法制片過程中不需要剔除植入到骨組織中的植入物，保持了骨組織與植入物之間原有的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，可直觀反應(yīng)結(jié)合界面的組織生長結(jié)合情況，這對骨缺損修復(fù)試驗(yàn)的組織長入研究具有重要意義，可用于3D 打印多孔洞類材料組織長入等生物組織相容性研究[13]。

生物材料及醫(yī)療器械動物試驗(yàn)研究的目的是預(yù)測其應(yīng)用于臨床可能發(fā)生的不良反應(yīng)，是醫(yī)療器械臨床前安全性評價(jià)必須進(jìn)行的一項(xiàng)試驗(yàn)研究[14]。動物試驗(yàn)研究組織病理學(xué)評價(jià)是該評價(jià)體系中重要的一環(huán)，用以確定產(chǎn)品組織相容性，是評價(jià)其安全性并判定是否可以應(yīng)用于臨床的重要研究手段[15，16]。樹脂包埋法制備病理組織切片無需進(jìn)行脫鈣處理，在動物試驗(yàn)研究中結(jié)合動物活體親骨熒光素標(biāo)記技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)動態(tài)測量骨修復(fù)過程中的新生骨礦化率和礦化速率，進(jìn)行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)研究[17，18]。制備的病理組織切片最顯著的特點(diǎn)是不破壞植入到骨組織中的植入物，保持了骨組織與植入物之間原有的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，該技術(shù)方法結(jié)合掃描電鏡技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)觀察成骨細(xì)胞在骨修復(fù)材料表面及孔隙內(nèi)附著及生長情況，從而判斷骨修復(fù)程度，同時(shí)結(jié)合掃描電鏡技術(shù)可實(shí)現(xiàn)觀察骨修復(fù)材料表面侵蝕及骨質(zhì)沉積情況的研究[19-22]。

20世紀(jì)80年代，為研究骨組織的礦化程度及新骨形成情況，塑料包埋技術(shù)開始應(yīng)用于骨組織病理切片的制備，近年來許多實(shí)驗(yàn)室在塑料包埋方法上進(jìn)行了創(chuàng)新，特別是在包埋聚合液及其聚合條件方面做了多種改進(jìn)[23-26]。有文獻(xiàn)報(bào)道用甲基丙烯酸甲酯（MMA）及鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）為滲透劑，甲基丙烯酸甲酯為包埋劑，包埋聚合制備骨組織塑料包埋切片的技術(shù)方法，但這一制片技術(shù)因操作煩瑣，制作周期長，且塑料包埋塊制備過程復(fù)雜，組織切片制備過程對溫度要求高，目前該技術(shù)方法仍然在用，但未得到廣泛應(yīng)用[27，28]。本研究制備不脫鈣骨組織病理切片包埋劑采用的是光聚樹脂，通過黃光與藍(lán)光共同輻照完成組織包埋塊的包埋聚合，與傳統(tǒng)的" 石蠟包埋組織切片" 方法及" 塑料包埋技術(shù)" 組織切片方法制備骨組織病理切片所用的包埋劑不同，組織標(biāo)本的浸潤處理及切片方式也不同。

本研究制備的含骨修復(fù)材料腰椎椎體不脫鈣病理組織切片，光學(xué)顯微鏡下可清晰觀察骨缺損部位植入骨修復(fù)材料后組織結(jié)合界面骨的各種組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可進(jìn)行骨缺損修復(fù)后骨組織重建進(jìn)程及炎癥反應(yīng)研究，適用于生物材料及醫(yī)療器械臨床前動物試驗(yàn)安全性評價(jià)的組織病理學(xué)研究。

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